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凝胶电泳色谱仪的支持介质

2021-08-12 来源:乌兰察布机械信息网

凝胶电泳色谱仪的支持介质

电泳仪是利用在电场作用下待分离样品中各分子带电性质、分子大小和形状等差异,使带电分子产生不同的迁移率,从而对样品进行分离。自由界面电泳仪没有支持介质,扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳仪,减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳仪的发展,使电泳仪成为分离蛋白质和核酸等生物大分子的重要手段之一。凝胶电泳色谱(简称凝胶电泳)较初使用的凝胶是淀粉凝胶,目前使用较多的是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

一、聚丙烯胺凝胶:

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(CH2 = CH-CO-NH2,简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(CH2 = CH-CO-NH-CO-CH = CH2,简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状凝胶,凝胶孔径大小由丙烯酰胺的浓度决定。

聚丙烯酰胺凝胶电泳适于分离小分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析,装载的样品量大,分辨率高,回收DNA纯度高即能分离长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子。

(1)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:

在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象,这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率不同。

由于分子的空间结构影响,同等大小的DNA之间的电泳迁移率可相差10%。因此,不能用非变性聚丙烯胺凝胶电泳判断DNA分子大小。

(2)变性聚丙烯胺凝胶电泳:

1)DNA变性:采用加热、极端pH、有机溶剂、尿素或甲酰胺导致DNA解链。

2)凝胶中加入变性剂:5M的尿素,使DNA为单链线性,变性DNA的移动速度与其碱基组成和序列几乎完整无关。

变性聚丙烯胺凝胶电泳可用于DNA序列分析等。

二、琼脂糖凝胶:

琼脂糖是从琼脂中分离得到,由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水β-D吡喃半乳糖组成,形成相对分子量为104~105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布,当温度降低时,链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接形成孔径结构,随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。

由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用,常用过酸或过碱等破坏氢键形成的方法可使凝胶再溶化。

琼脂糖凝胶电泳分辨率稍低,适于分离较大分子物质。

1、一般琼脂糖凝胶电泳:

在一定浓度的琼脂糖凝胶中,DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。

DNA分子的空间结构对电泳迁移率也有影响,共价闭环DNA>直线DNA>开环双链DNA。

2、脉冲电场凝胶电泳:

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时,在电场作用下迫使DNA变形挤过筛孔,而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不大,此时凝胶的分子筛效应不明显。若改变电场方向,则DNA分子会改变其构象,沿新的泳动方面伸直,电场转向时间与DNA分子大小关系极为密切。

脉冲电场凝胶电泳可分离1000~5000kb的DNA片段。

3、RNA琼脂糖凝胶电泳:

RNA琼脂糖凝胶电泳同DNA,只是用变性琼脂糖凝胶电泳,以防止RNA二级结构的形成。

关键是防止RNase污染,一般用DEPC(0.1%)焦碳酸二乙酯。

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